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Extração de DNA, reação de polimerase em cadeia e eletroforese em gel de agarose

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Resumo

A biologia molecular é a área das ciências biológicas que mais tem se desenvolvido nos últimos 50 (cinqüenta) anos. A biologia molecular é o estudo da biologia a nível molecular, com foco especial na estrutura e função do material genético e seus produtos de expressão, as proteínas. Mais concretamente a biologia molecular investiga as diversas interações entre sistemas celulares, incluindo as relações entre DNA, RNA e sínteses protéica. A bio. mol. Abrange outras áreas de biologia e da química, em especial a genética e a bioquímica. Tradicionalmente a seleção de animais tem sido feita com base em desempenhos fenotípicos. Esse tipo de seleção pode ter sido influenciado por fatores de meio que marcou o mérito genético, no entanto, esse método não tem sido efetivo para características econômicas de baixa herdabilidade. O avanço da genética molecular, através de seus mapas genéticos e marcadores moleculares, facilitou enormemente a seleção de aracterísticas de interesse econômico em várias espécies domesticas.

Introdução

O DNA é composto por manômeros chamados nucleotídeos. Cada nucleotídeo é formado por um ácido fosfórico, um açúcar de cinco carbono – desoxiribose - e quatro bases nitrogenadas: adenina (A); guanina (G); timina (T); citosina (C). Estas bases nitrogenadas estão destribuídas em dois grupos: Purinas: adenina e guanina; pirimidinas: tiamina e citosina.

Desenvolvimento

Watson e Crick (1953), propuseram a estrutura molecular do DNA, para tanto, consideraram as propriedades químicas de seus componentes, bem como, as evidencias obtidas por Chargaff et.al., sobre a composição de bases do DNA de diferentes espécies; bem como, dos estudos de Franklin e Wilkim sobre a difração com raio X..De acordo com Watson e Crick (1953), o DNA tem sua estrutura molecular constituída por duas fitas paralelas, enroladas para a direita em forma de dupla hélice. A ligação do açúcar-fosfato ocorre de tal forma que a osição 3’ da molécula de açúcar liga-se ao grupamento fosfato, o qual liga-se à posição 5’ da molécula de açúcar subseqüente. Nota-se que as duas fitas ocorrem em direção opostas – enquanto uma fita dar-se de 5’a 3’, a outra ocorre de 3’ a 5’, por essa razão chamadas de antiparalelas.

Extração de DNA

Materiais:
Abelhas; Laminas de bisturi; Placas de Petri; Bastões de vidro; Luvas; Ependorfs; estantes para ependorfs; micropipetas; Vortex; Micro centrifuga; Banho maria.

Soluções:
Tris-HCL 10mM, pH 7,5;Tampão de Extração;Proteinase K (5mg/mL), conservada em frezer;NaCl 5M;Etanol P.A. (absoluto);Etanol 70%TE (Tampão de Eluição).Obs. Todas as soluções já se encontravam preparadas.

Procedimentos:
Nesta prática foi utilizada uma técnica para amostras com pequena quantidade de DNA. Foram coletadas três amostras de fragmentos (Melípona sp) de tórax, asas e tarso.
1.) Separou-se 10 a 50mg de uma abelha (Melípona sp)o tórax, a asa e tarso;
2.) Macerou-se as amostras individualmente em placas de Petri;
3.) Transferiu-se o macerado (amostras) para tubos de ependorf de 1,5mL; 
4.) Microcetrifugou-se as amostras para concentrar-las no fundo dos ependorfs; 
5.) Lavou-se as amostras em solução Tris-HCl 10mM em pH 7,5 por 5 min; 
6.) Microcetrifugou-se por 10s, removeu-se o sobrenadante;
7.) Adicionou-se 300μL de Tampão de Extração, colocando-se em seguida 10μL de Proteinase K (de acordo com o tecido utilizado);
8.) Misturou-se bem, (microcentrifugar,vortexar) e colocou-se em banho maria por 2 a 3h, agitou-se ocasionalmente por inversão a cada 20min., ate dissolver o tecido;* Esta etapa pode permanecer over night a 37ºC.** Os procedimentos dos itens 9 a 19 só foram realizados na aula do dia seguinte.
9.) Retirou-se do BM, vortexou-se e centrifugou-se rapidamente (13.000 rpm por 5min a 20ºC);
10.) adicionou-se 100μL de NaCl 5M; vortexou-se por 10min;
11.) Centrifugou-se (13.000 rpm por 10min a 20ºC);
12.) Coletou-se o sobrenadante para outro tubo ependorf;
13.) Adicionou-se 1 mL de álcool P.A. gelado;* **Agitou-se e observou-se a formação de uma nuvem (filamentos) de DNA.**** Esta etapa pode permanecer over night a -20ºC.
14.) Centrifugou-se (13.000 rpm por 10min a 4ºC), e desprezar o sobrenadante, conservando-se o pellet formado;
15.) Adicionou-se 500μL de álcool 70%. Agitou-se bem e centrifugou-se (conforme o item 12 para reduzir o tempo para 5min.). Desprezou-se o sobrenadante, repetiu-se esta operação mais uma vez. 
16.) Verteu-se os tubos ependorfs sobre papel absorvente para secar os tubos.
17.) Adicionou-se 50μL de Tampão de Eluição;
18.) Agitou-se e colocou-se os tubos ependorfs em BM a 55ºC por aproximadamente 15min., ate a dissolução dos pellets;
19.) Estocou-se as amostras entre 4ºC e 20ºC.

Discussão:
Nesta prática foi utilizada uma técnica para amostras com pequena quantidade de DNA. Foram coletadas três amostras de fragmentos (Melípona sp) de tórax, asas e tarso. A maceração realizado no item 2 foi para aumentar a superfície de contato do substrato (tecido) com a enzima proteinase K, facilitando a digestão da membrana celular e outros constituintes. No item 4 a microcentrifugação realizada serviu para juntar todos fragmentos da amostra no fundo do ependorf. Na 5ª etapa, caso a amostra tenha sido conservada em álcool, esta deve ser lavada com água para retirar o excesso de álcool e facilitar a ação do Tris-HCl.No item 7 a solução tampão de extração manem o pH da célula (ambiente) inalterado para que não ocorra destruição do DNA. Já no 8º passo o bm ajuda na aceleração da reação facilitando a quebra das moléculas da membrana e citoplasma. A solução de NaCl presente na etapa 10 deste protocolo irá retirar a água presente no substrato.Nas etapas 13 e 15 o álcool fixara e desnaturará o DNA tornando-o visível; se não se utilizar uma membrana em coluna o DNA se deposita no fundo do tubo. No item 17 o Tampão de Eluição contem Tris-Hcl para lavar e retirar o execesso de álcool e RNAse que fará a lise das moléculas de RNA.

Reação de PCR

O objetivo da PCR é multiplicar um trecho especifico do DNA (gene ou parte dele, regiões supravaráveis, Junk DNA, etc).“A PCR utiliza-se de desoxinucleotideos como manomeros ate um ponto em que sua concentração em dada solução seja tão alta que possa ser facilmente detectável por métodos simples e clássicos de separação e identificação de substancias” – Saiki et. al., 1985; Kary Mullis, 1987.

A multiplicação desses trechos específicos se dá alternando-se a temperatura de ensaio entre:
1- Desnaturação das cadeias de DNA genomico (~ 95ºC);
2- Anelamento (annealinng) dos primers, usados paara delimitar a seqüência a ser amplificada (50ºC a 70ºC);
3- Extensão dos produtos PCR (72ºC);
4- Reinicio do Ciclo (32X).

Materiais:
Balança analítica; microcentrifuga; centrifuga refrigerada; cubas e fonte para eletroforese horizontal; sistema de fotodocumentação; transluminador; frezer vertical; autoclave vertical; capela de fluxo laminar horizontal; termociclador; vortex; banho maria; forno microondas; estufa de esterilização e secagem; barrillete para água destilada; ponteiras; micropipetas; ependorfs; e suportes para ependorfs.

Soluções/produtos:
DNA para amplificação;
Par de primers específicos;
Enzima tag polimerase;
Tampão; 
MgCl2;
dNTPS;
H2O ultrapura.

Procedimento:
O material utilizado nesta pratica foi amostras de DNA de carangueijos – 06 amostras.Para preparação da quantidade do mix a ser utilizado nesta pratica fez-se uso de uma tabela (programa) elaborada pelo Dr. Fabio Brito, que facilita muito a elaboração do mix para a PCR.
1.) Preparou-se em um ependorf o mix dreação com todos os reagentes descritos acima, exceto o DNA da amostra. 
2.) Distribuiu-se o mix em tubos ependorfs para PCR;
3.) Colocou-se uma a uma, as amostras, (5 μL de DNA) a serem testadas nos tubos;
4.) Levou-se as amostras ao termociclador previamente programado;

Discussão:
A PCR é uma reação bioquímica que a partir de uma cópia de uma molécula de DNA dá origem a várias outras copias, que obedecem a seguinte seqüência replicação (DNA), transcrição (RNA) e tradução (formação de proteínas especificas). O código genético apresenta 64 combinações diferentes para os codons.

Quanto maior a concentração de Mg++ maior será a especificidade da reação.

A seqüência dos primers determinará o comprimento do produto PCR, sendo que o comprimentoé dependente do local onde os primers fazem o anelamento.
A tag polimerase só reconhece as moléculas de DNA.

Durante os ciclos da reação PCR observa-se as etapas de desnaturação, linearidade do DNA (abertura das fitas) entre 92 a 95ºC, o anelamento (hibridação) que ocorre entre 50 a 70ºC, nesta fase a tag começa a ligar as bases e formar novas cadeias; bem como a extenção (síntese do DNA) que dá-se entre 70 a 75ºC, as cadeias que eventualmente ficaram inacabadas iram se formar. Ao atingir – 4 ºC + ∞ ocorrerá a estabilização do DNA.

Eletroforese em gel de agarose: 
A eletroforese em gel de agarose permite a separação de moleculas de DNA em função de seu tamanho. Dependendo da faixa de separação requerida, utilizam-se diferentes concentrações de agarose, variando-se de 0,5 a 3%. Assim para uma separação de fragmentos variando de 0,5 a 10kb, usa-se uma concentração de 0,8 a 1,0%. Em fragmentos maiores usa-se uma concentração menor de agarose – de ate 0,5%. Se com fragmentos menores de 50 a 500 bp, malha mais fina– concentração de 2 a 3% de agarose.

Tampão:
Para que o pH não se altere na corrida eletroforetica e garanta a formação de um campo elétrico usa-se uma solução de Tris/Borato/EDTA (TBE) ou Tris/Acetato/EDTA (TAE) em pH alcalino.

Procedimentos:
1. Pesou-se 0,8 g de agarose. Adicionou-se 100mL de tampão TBE (Tris-borato 89mM, EDTA 2mM pH8). 
2. Aqueceu-se em banho fervente e misturou-se até completa dissolução da agarose. 3. Enquanto esperava-se a dissolução da agarose, preparou-se a forma para o gel. 4. Resfriou-se a solução (gel) até 40° C (até conseguir-se segurar com as mãos).
5. Acrescentou-se 5m L de uma solução de brometo de etídio 10mg/mL.
* CUIDADO BROMETO DE ETÍDIO É CARCINOGÊNICO!
6. Despejou-se a solução sobre a forma para o gel previamente preparada, incluindo a colocação do pente; teve-se o cuidado de não haver formação de bolhas. Deixou-se solidificar por pelo menos 30min. 
7. Retirou-se o pente e transferiu-se o gel para a cuba. Adicionou-se tampão TBE à cuba de modo a cobrir o gel com menor volume possível. 
8. Aplicar as amostras preparadas nas duas experiências anteriores. Aplicar o marcador de tamanho em uma das canaletas. Anotou-se a ordem de aplicação das amostras no gel. 
9. Ligou-se a fonte de eletroforese e aplicou-se aproximadamente 100V. Cuidado para não tocar o tampão.
10. Interrompeu-se a eletroforese quando o corante azul de bromofenol estiva a 0,5cm do fim do gel. O corante xileno-cianol mostra coloração esverdeada. 
11. Transferiu-se o gel para o transiluminador e, em seguida observou-se o gel sob luz UV, utilizando óculos protetores, em seguida levou-se o gel para o sistema de fotodocumentação por escanner digital. 
* A luz UV é lesiva à pele e especialmente aos olhos, podendo cegar rapidamente. Deve-se usar sempre óculos especiais de proteção.

Discussão:
O DNA tem carga elétrica negativa, então quando submetido a um campo elétrico ele migrará para o pólo positivo. O tamanho do DNA determina a taxa na qual ele passa através do gel, permitindo uma separação efetiva de mistura de fragmentos.
De modo geral os fabricantes de cubas sugerem valores ideais em volts, que variam na faixa de 50 a 150V, dependendo do tamanho da cuba (8 a, 10v por cm).
O brometo de etidium intercala-se com a molécula de DNA a cada 2,5 bp do fragmento, após sua inserção esse exerce uma ligação do tipo van der Waals. A radiação UV é capaz de estimular essa ligação entre o DNA e o corante tornando a molécula ou banda visível no gel através de um dispositivo de transiluminação. 

Alguns fatores determinam a migração do DNA através do gel de agarose: 
a) tamanho da molécula de DNA 
b) concentração da agarose 
c) conformação do DNA (formas circulares ou não lineares: I; II e II I) 
d) a presença de brometo de etidium no gel 
e) voltagem aplicada 
f) tipo de agarose 
g) tipo do tampão de eletroforese

O DNA permanece intacto durante o processo de eletroforese, podendo ser eluido do gel e utilizado em outros procedimentos como clonagem, preparação de sondas,construção de bibliotecas, etc.

Referencias Bibliográficas:
AZEVEDO, Ana Luisa Sousa. 2006. Varredura genômica para QTL associados à resistência a Boophilus microplus em bovinos. 65 p. Universidade Federal de Viçosa. Dissertação de Mestrado.
AUSUBEL, FM., et al (1997) Current protocols in molecular biology. John Wiley & Sons, Inc. New York.
Metods in Molecular Biology, vol. 226: PCR Protocols, Second Edition Edited by: J. M. S. Bartlett and D. Stirling © Humana Press Inc., Totowa, NJ.

PCR - REALTIMEPCR - REALTIME

RONALDO SOUSA SANTOS
Doutorando em Genética e Melhoramento Animal - UFPI

Comentários  

 
+2 #1 Usman 29-08-2011 14:46
Muito bem adorei ter lido.
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